高效液相色谱基础知识- - - - - -
原则和参数

液相色谱法是一种成熟的物质分离技术。高效液相色谱(HPLC)是一种适用于分析的方法，具有广泛的应用领域。在这里，我们描述了高效液相色谱的原理，并介绍了高效液相色谱系统中最重要的成分和决定测量成功的因素。

高效液相色谱法原理

高效液相色谱的分离原理是基于分析物(样品)在流动相(洗脱液)和固定相(色谱柱的填充材料)之间的分布。根据分析物的化学结构，分子通过固定相时被阻滞。样品分子和包装材料之间的特定分子间相互作用定义了它们的“列上”时间。因此，样品的不同成分在不同的时间被洗脱。从而实现了样品成分的分离。
检测单元(如紫外检测器)在离开色谱柱后识别分析物。信号由数据管理系统(计算机软件)转换和记录，然后显示在色谱图中。通过检测器单元后，流动相可受到附加检测器单元、碎片收集单元或废物处理。通常，高效液相色谱系统包含以下模块:溶剂储层、泵、进样阀、色谱柱、检测单元和数据处理单元(图1)。溶剂(洗脱液)由泵以高压、恒速输送通过系统。为了保持探测器信号的漂移和噪声尽可能低，从泵的恒定和无脉冲的流量是至关重要的。分析物(样品)由进样阀提供给洗脱液。

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梯度和权力平等主义的

根据流动相的组成，一般可采用两种不同的模式。如果流动相的组成在分离过程中保持不变，则HPLC体系被定义为等晶洗脱体系。当分离过程中流动相组成发生变化时，将HPLC体系定义为梯度洗脱体系。[1,2]使用梯度系统，有两种不同的技术:低压梯度(LPG)和高压梯度(HPG)。低压梯度意味着溶剂的混合在泵的上游(吸入侧)进行。在高压梯度系统中，不同的溶剂由单独的泵提供，并在泵(排出侧)后混合。图2显示了LPG和HPG梯度模式的系统配置示例。

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列

该柱代表任何高效液相色谱系统的心脏。它负责样品成分的充分分离。分离效率与柱内径、柱长、填料的类型和粒度有关。根据需要的应用，市面上有大量的HPLC色谱柱。不同的包装材料支持不同的分离机制-常见的是材料的正相，反相，尺寸排斥，离子交换，亲和，手性，或亲水相互作用HPLC。图3所示为分析柱和制备柱。

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探测器

检测器的任务是记录从色谱柱中洗脱出来的物质的时间和数量。检测器感知洗脱液成分的变化，并将此信息转换为电信号，由计算机辅助进行评估。根据分析物的结构特征，有各种各样的检测器可供选择。常用的检测器单元有折射检测器、紫外/可见检测器、电化学检测器和荧光检测器。图4显示了两种具有不同检测器的等ocratic系统结构。

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色谱参数

被流动相运输的分离的分析物被检测器记录为信号峰。所有峰的总量称为色谱。每个单独的峰提供分析物的定性和定量信息。定性信息是由峰本身给出的(例如:信号的形状，强度，在色谱中出现的时间)。此外，峰的面积与物质的浓度成正比。因此，色谱数据管理软件可以积分计算样品浓度。这提供了定量的信息。理想情况下，峰值记录为高斯钟形曲线。图5给出了一个示意图示例。下面讨论色谱分离的基本参数。

延迟时间(t0)
延迟时间是指非延迟化合物从注射部位运输到检测器单元(记录化合物的地方)所需要的时间。在此期间，所有样品分子都只位于流动相。一般来说，所有样品分子共享相同的延迟时间。这种分离是由于物质与固定相的粘附性不同造成的。

保留时间(tR)
保留时间是指化合物从注射时刻到检测时刻所需要的时间。因此，它表示被分析物在流动相和固定相中的时间。保留时间是特定物质的，在相同条件下应该始终提供相同的值。

峰宽(w)
峰值宽度涵盖从信号斜率开始到检测器信号反复下降后到达基线的周期。

拖尾因子(T)

实际上，完全对称的峰是非常罕见的。在色谱中，它们常显示出一定程度的尾迹。峰值尾砂由尾砂因子t测量，该因子描述了峰值的不对称性，即形状在多大程度上近似于完美对称高斯曲线。测试尾端因子为:T=b/a a为峰前半段宽度，b为峰后半段宽度。从峰的前缘或后缘到从峰顶垂直下降的直线的10%的峰高处测量值(见图5)。[4]T = 1为对称峰。对于t> 1，其峰廓线称为拖尾。对于T < 1，峰廓线被称为锋面。